产品目录

本制品是对M-MuLV(RNase H-)进行基因工程改造，表达并纯化的高温逆转录酶，比M-MuLV(RNase H-)提高了热稳定性。该酶可以在高温条件下(50～60℃)进行cDNA第一链的合成，高温条件下有利于打开复杂RNA模板链。该酶最佳反应温度为50℃，具有热稳定相强，灵敏度高，特异性高，聚合能力强等优点。

• 1st Strand cDNA的合成；
  
• cDNA Probe的制备；
  
• RT-PCR反应以及Real Time RT-PCR反应。

• 用DEPC处理实验用到的所有实验器材，或者购买已经证明无核酸酶的实验用具，实验过程戴手套并经常更换手套，避免RNA酶的污染。
  
• 确保所用试剂及超纯水中无RNA酶污染。
  
• 试剂盒要严格密封保存。在反转录过程中，所有管子确保扣严。
  
• 纯化过的RNA必须保证不含有盐，金属离子，乙醇和苯酚，以上成分会干扰第一链cDNA的合成反应。可采用乙醇沉淀RNA的方法去除掉痕量污染物。
  
• 为保证反转录反应的有效进行，需使用高质量的RNA模板。
  
• 最快可达2kb/min，需要提高反转录效率或模板含量较低时可以适当延长反转录时间。

• 按顺序加入以下反应物：
  

  成分		用量
  模板RNA	总RNA	0.1ng～5μg
  	poly(A) mRNA	10pg
  	特异性RNA	0.01pg
  引物	Oligo(dT)18	1μL
  	Random N6	1μL
  	基因特异性引物	15～20pmol
  5×BalbScript RT Buffer		4μL
  RNase Inhibitor(40U/μL)		1μL
  dNTPs(10mM)		2μL
  BalbScript II反转录酶(200U/μL)		1μL
  RNase-Free Water		至20μL

  
  
• 可选优化步骤：如果RNA模板GC含量高或含有二级结构，可先将模板与引物的混合液轻轻混匀，短暂离心，65℃孵育5min，冰上冷却。
  
• 轻轻混匀，离心。
  
• 如果使用Oligo(dT)18或者基因特异型引物，50℃孵育15～30min。
  使用随机六聚体引物时，25℃先孵育5min，随后50℃孵育15～30min。
  对于高GC含量或者具有复杂二级结构的RNA模板，使用60℃孵育15～30min。
  
• 70℃加热5min终止反应。
  反应产物可直接用于PCR反应，如果不立即使用，-20℃保存少于一周的时间。长时间保存建议-70℃放置。